一、实验准备

尊龙凯时多能干细胞培养基的制备：

(1) 在2-8℃条件下解冻hPSCMediumSupplement，融化后轻轻摇匀。根据实际需要进行分装，立即使用或储存于-20~ -80℃的环境中，避免反复冻融；

(2) 将hPSCMediumSupplement（10mL）按1:50比例加入hPSCMediumBasalMedium（500mL）中，充分混合，得到多能干细胞培养基（abs9403）。注意：混合后的人多能干细胞培养基可在2-8℃下稳定保存2-3周，不建议使用超过3周的培养基。

(3) 实验试剂平衡：在实验前，将人多能干细胞培养基放置于室温避光环境中平衡，PBS和消化液等应在37℃下加热。注意：培养基中的成分不应通过37℃水浴加热。

二、操作方法（以下步骤均应在无菌环境下进行）

hPSC细胞复苏：

1、实验操作步骤：

1.1 基质胶包被培养板：使用6孔板或12孔板，每孔加入即用型基质胶（abs9410）1mL/0.5mL，轻轻摇动使其完全覆盖皿底，随后放置于37℃培养箱中孵育1-2小时。实验前再取出并在超净工作台或生物安全柜中室温平衡20分钟。如暂不使用，可用Parafilm封口后在2-8℃中储存，并于1周内使用。

注意：① 一支冻存的干细胞数量约为1×10^6 cells/mL，适合6孔板1孔使用；② 即用型基质胶对温度敏感，使用后需立即存放于4℃冰箱，切勿用手直接接触基质胶液面以免影响其质量。

1.2 准备2-3mL的干细胞培养基放入15mL离心管中备用。

1.3 解冻：将冻存管快速浸入37℃温水中，快速摇动以在1-2分钟内解冻。注意：细胞从液氮中取出的速度应尽量快，以减少其在室温下的暴露时间。

1.4 离心：解冻后的液体逐滴加入含有干细胞培养基的15mL离心管中，平衡后在低速离心机中以1000rpm速度离心3分钟。

1.5 重悬：离心后弃去上清液，加入1mL人多能干细胞培养基对沉淀进行吹吸混匀，轻柔吹吸3-5次。

1.6 接种：将平衡好的即用型基质胶弃掉，将均匀的干细胞悬液加入包被好的6孔板中，每孔补全2mL培养体系。

1.7 培养：接种后的6孔板可使用倒置相差显微镜观察干细胞的密度和团块大小。理想状态下，团块应有4个细胞以上。用水平十字轻轻摇动6孔板以使细胞均匀分布，并置于37℃、5% CO2的恒温培养箱中培养。第2天观察细胞的贴壁情况。

1.8 换液：自复苏日起每24小时更换培养基。注意：因培养基中的活性成分只能维持一天，需及时更换新鲜培养基。

hPSC细胞传代：

2、具体操作步骤：

2.1 清洗：吸掉原有培养基，慢慢加入1mL PBS缓冲液并轻轻摇动，然后沿培养皿边缘吸去PBS。

2.2 消化：加入2mL/孔人多能干细胞消化液（abs9409）覆盖皿底，置于37℃培养箱中2-5分钟。消化时间可根据干细胞的生长密度略有不同，一般建议时间为2-5分钟。如在显微镜下观察到细胞之间出现间隙，即可吸掉消化液终止消化。

2.3 吹打：吸掉消化液后，加入2mL人多能干细胞培养基，使用移液枪轻柔吹打皿底3-5次，使细胞团块脱落，并转移至15mL离心管中。注意：操作要轻柔，避免造成单细胞分散。如有少量细胞无法脱落属正常现象，大量细胞未脱落则需延长消化时间。

2.4 离心：以1000rpm离心3分钟，弃去上清。

2.5 接种：用干细胞培养基轻柔吹打细胞5-10次，吸掉包被培养板中的基质胶，将细胞悬液加入培养板中，并补全每孔2mL的培养体系。注意：操作时要温柔，吹打次数不超过10次。

2.6 换液：自传代开始每24小时更换培养基。注意：培养基中的活性成分仅能维持一天，需及时更换新鲜培养基。

hPSC细胞冻存：

3、具体操作步骤：

3.1 清洗：同2.1；

3.2 消化：同2.2；

3.3 吹打：同2.3；

3.4 离心：同2.4；

3.5 重悬：弃去上清，加入2mL ES/iPS细胞冻存液（abs9412）进行混匀，完成后转入冻存管中。注意：冻存液务必及时放回4℃冰箱。

3.6 记录：在冻存管上注明细胞种类、冻存时间、操作者及细胞批次信息。

3.7 -80℃冰箱冻存：冻存管需在-80℃冰箱中过夜，必须保持直立放置，切忌倾斜或横放。

3.8 液氮冻存：24小时后，将-80℃冰箱中的细胞转移至液氮中进行长期保存。

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